초록
약용으로 사용되고 있는 곤충자원 중에서 누에나방 (Bombyx mori)을 대상으로 렉틴을 추출하였고, 생화학적 특성과 면역기능 증강효과를 실험하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
한국산 누에나방 유충으로부터 ammonium sulfate로 단백질을 분리하고, DEAE Sephadex A-50 column과 Sephadex G-200 column을 이용하여 렉틴을 정제하였고, 이를 BML이라고 명명하였다.
BML은 사람의 적혈구에 대해서 응집현상을 나타내지 않았고, 토끼와 닭의 적혈구, Rat의 림프구 등에서 높은 응집현상을 나타냈다. pH에 대한 활성 효과는 강산과 강염기에서 억제되었고, 다른 렉틴보다 높은 열 안정성을 보여 90℃까지 렉틴의 활성이 관찰되었는데, 이는 17.16%의 당 함량으로 인한 결과로 사료되었다.
금속이온 중에서 특히 Ca2+과 Fe2+, Mn2+ 의존성을 나타낸 반면, Mg2+ 에 의해서는 억제되었다. 당에 의한 응집 저해 효과는 글루쿠론산에서 강한 특이성을 나타내었고, 헤파린에 의한 저해효과도 보였다. 또한 약 42 kDa과 52 kDa의 2개의 subunit으로 구성된 단백질로 추정되었다.
BML을 사용하여 PBMC를 대상으로 농도별, 시간별로 자극한 뒤, IL-1, IL-2, IL-6, IFNγ 및 TNFα 등 다섯 종류의 사이토카인 발현을 RT-PCR로 측정하였다.
흡광도 0.1을 적정농도로 결정하여 1, 4, 8, 24, 48 및 72 시간 동안 반응시킨 뒤 관찰된 사이토카인의 발현 양상을 확인한 결과, IL-1은 1시간에서 8시간까지, IL-2는 72시간까지, IL-6는 4시간에서 8시간까지, IFNγ는 48시간에서 72시간까지, 그리고 TNFα는 반응 1시간에서 8시간까지 강한 발현을 나타냈다. 이 실험에서 BML의 IL-2와 IFNγ의 유전자 발현양상은 다른 사이토카인과는 현저한 차이가 있음이 확인되었는데 시간이 경과할수록 band가 강해짐을 관찰되었다.
한편 사이토카인의 생성에 관한 실험은 ELISA 방법으로 실시하였다. IL-2의 경우, BML의 자극에 의해 서서히 증가해 48시간에서부터 다소 강한 생성량을 나타냈고, IFNγ은 반응 24시간부터 현저하게 증가하여 72시간에 최고의 생성량이 관찰되었다. 이 결과는 유전자 발현 양상과 거의 일치하였고 BML이 사이토카인 발현 및 생성능이 있음을 입증하여 면역 증강제로서의 가능성을 시사하는 것이었다.
추후 누에 렉틴의 아미노산 서열과 구조를 밝히는 작업 등, 생화학적 성질 구명에 관한 연구가 계속되어야 할 것이다.
A new lectin was purified from Bombyx mori (BML) by physiological saline extraction, ammonium sulfate precipitants, anion exchange column chromatography on DEAE Sephadex A-50 and gel filtration column chromatography on Sephadex G-200.
BML agglutinated trypsinized and glutaraldehyde-fixed erythrocytes, and was observed the most high activity with rabbit and chicken erythrocytes, and rat splenic lymphocytes. Agglutinability was markedly affected at highly acidic pH, but was relatively stable with high temperature. The effect of metal ions was observed and BML was affected by bivalaent cations, especially depending on Ca2+, Fe2+, Mn2+, whereas, inhibited by Mg2+.
Agglutination was strongly inhibited by heparin and glucuronic acid. BML was proved to be a glycoprotein which contains 17.16% of sugars.
By mass spectrometry analysis, we found 2 bands that were considered as lectin subunits.
An assay for cytokine expression was carried out by using reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). mRNA isolated from PBMC(human peripheral blood mononuclear cells) were stimulated with BML(O.D.=0.1) for various times(1, 4, 8, 24, 48 and 72 h) and various cytokine mRNA assessed by RT-PCR were shown as follows:
The patterns of bands for IL-1 mRNA of BML were decreased along the increasing reaction times after showing a strong band at 1 h. Meanwhile, the bands for IL-2 and IFNγ were increased along the increasing reaction times until 72 h. The strongest bands were showed from 4 to 8 h with IL-6 and at 8 h with TNFα.
To verify quantitatively ELISA was used for assay of protein secretions of the cytokine gene with IL-2 and IFNγ. The highest cytokine secretion for IL-2 was demonstrated at 48 h. The production of IFNγ was markedly increased at 24 h and secreted highest at 72 h.
These results suggest that BML, as inducers of cytokines, can elicit detectable cytokine mRNA from PBMC within the first few hours of stimulation and maintain the production of cytokines for a few days.
목차
표제지
목차
I. 서론 7
II. 재료 및 방법 12
1. 실험 재료, 시약 및 기기 12
1) 실험 재료 12
2) 시약 12
3) 기기 14
2. 실험 방법 15
1) 렉틴의 분리 및 정제 15
2) 렉틴 활성 실험 16
3) 렉틴의 생화학적 특성 17
4) 면역기능 증강효과 19
III. 결과 22
1. 렉틴의 분리 및 정제 22
1) Crude 렉틴의 분리 22
2) DEAE Sephadex A-50 column chromatography에 의한 정제 22
3) Sephadex G-200 column chromatography에 의해 정제 22
2. 렉틴 활성 실험 26
1) 적혈구 및 림프구 응집력 시험 26
2) pH의 영향 26
3) 온도의 영향 26
4) 금속 이온의 영향 26
3. 렉틴의 생화학적 특성 31
1) 당 특이성 31
2) 당 함량 분석 31
3) 단백질 동정 31
4. 반응 농도에 따른 사이토카인 유전자 발현 양상 35
5. 반응 시간에 따른 사이토카인 유전자 발현 양상 39
6. 반응 시간에 따른 사이토카인 생성량 46
IV. 고찰 48
V. 요약 55
참고문헌 57
Abstract 65
List of Tables
Table I. Purification of lectins from B. mori. 23
Table II. Specificity of BML on agglutination of erythrocytes from various species and rat splenic lymphocytes 27
Table III. Effect of pH on hemagglutinating activity of BML 28
Table IV. Effect of metal ions on hemagglutinating activity of BML 30
Table V. Inhibition of agglutination by sugars to the trypsinized rabbit erythrocytes with BML 32
Table VI. Kinetics of cytokine mRNA expressions in PBMC stimulated with BML for 1 hour and 20 hours 38
Table VII. Kinetics of cytokine mRNA expressions in PBMC stimulated with BML 45
Table VIII. Generation of IL-2 and IFNγ in culture supernatants by PBMC stimulated with BML 47
List of Figures
Fig. 1. Elution profile of B. mori crude lectins on DEAE Sephadex A-50 column (2.6×40 cm) chromatography. (Absorbance at 280 nm: - , Lectin activity: ●-●, Salt gradient: -----, flow rate: 24㎖/hr). 24
Fig. 2. Elution profile of 0.05M fraction from DEAE Sephadex A-50 column on Sephdex G-200 column (1.6×40 cm) chromatography (Absorbance at 280 ㎚: , lectin activity: ●-●, salt gradient: -----, flow rate: 24 ㎖/hr). 25
Fig. 3. Effect of temperature on hemagglutinating activity of BML 29
Fig. 4. Electrophoretic patterns of BML on SDS-ployacrylamide gel. 33
Fig. 5. Peptide fingerprints of band 'a' (a) and 'b' (b) obtained by MALDI-TOF mass spectrometry. Band 'b' is truncated form of band 'a'. 34
Fig. 6. Dose dependent effect of BML on mRNA expression for various cytokines in PBMC cultured for 1 hour. The concentrations were represented as follows (the numbers mean optical densities): 36
Fig. 7. Dose dependent effects of mRNA expressions of BML on mRNA exprssion for various cytokines in PBMC cultured for 20 hours. The concentrations were represented as follows: (the numbers mean optical densities) 37
Fig. 8. PCR-assisted amplification of IL-1α (420 bp) mRNA from PBMC according to the increased reaction times. The bands for IL-1α were detected from 1 to 72 hrs. after stimulation with BML. 40
Fig. 9. PCR-assisted amplification of IL-2 (395 bp) mRNA from PBMC according to the increased reaction times. The bands for IL-2 were detected from 1 to 72 hrs. after stimulation with BML. 41
Fig. 10. PCR-assisted amplification of IL-6 (648 bp) mRNA from PBMC according to the increased reaction times. The bands for IL-6 were detected from 1 to 72 hrs. after stimulation with BML. 42
Fig. 11. PCR-assisted amplification of IFNγ (438 bp) mRNA from PBMC according to the increased reaction times. The bands for IFNγ were detected from 1 to 72 hrs. after stimulation with BML. 43
Fig. 12. PCR-assisted amplification of TNFα (706 bp) mRNA from PBMC according to the increased reaction times. The bands for TNFα were detected from 1 to 72 hrs. after stimulation with BML. 44
한국산 겨우살이 렉틴의 경구투여에 의한 항원 특이적 점막면역 증진 효과
Mucosal Immunoadjuvant Activity of Korean Mistletoe Lectin-C
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초록
The adjuvant effects of Korean mistletoe lectin-C (KML-C) were investigated following the oral administration of KML-C with ovalbumin (OVA) as an antigen. Mice were orally immunized with OVA alone or admixed with various doses of KML-C or cholera toxin (CT), and the titer of OVA-specific antibody in the serum and mucosal secretions were determined. OVA+KML-C-treated mice showed high titers of IgA specific to CT in mucosal secretions. The antibody titers in the serum of OVA+KML-C-treated mice were comparable to those in the serum of OVA+CT-treated mice. When mice were immunized with OVA+KML-C or with CT alone and subsequently injected with OVA on the footpads after the primary immunization, they showed a more significant increase in delayed-type hypersensitivity reactions than when they were administered CT alone. These results suggest that KML-C is a potent immunoadjuvant that enhances both humoral and cellular immunity by the mucosal immune system.
목차
Abstract 서론 재료 및 방법 시약 및 세포배양 한국산 겨우살이 렉틴의 분리 실험동물 및 면역 시료채취 항체 역가 측정 DTH test 통계처리 결과 및 고찰 OVA 특이적 IgA 형성에 미치는 역할 혈청 내 항원 OVA 특이적 항체의 역가에 미치는 영향 OVA 특이적 항체에 대한 Isotype 결정 지연성 과민반응(DTH) 유도에 미치는 영향 결론 감사의 글 문헌
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초록
본 논문은 솔비나무 유래 렉틴의 정제효율을 연구한 내용으로 주요 내용으로는 지난 연구에서 fetuin-affinity column 상에 알칼리 완충액을 이용하여 솔비나무로부터 sialic acid-특이 렉틴을 용출시켰는데, 본 연구에서는 붕산염-기반 용출 완충액을 사용하여 조단백질 추출물로부터 정제 렉틴의 비활성을 2.6배 증가시켰다. 붕산염 완충액으로 용출된 렉틴의 생물학적 성질은 적혈구응집반응 활성, 적혈구응집 억제활성, 분자량, 순도 및 사람 유방암세포에 대한 세포독성 면에서알칼리 완충액을 이용했을 때와 같았다. fetuin-affinity 칼럼에 흡수된 렉틴을 분리하는 측면에서는 알칼리 완충액보다 붕산염 완충액을 이용한 용출이 보다 효과적이라는 내용이다.
We previously reported the isolation of a sialic acid-specific lectin eluted from the bark of Maackia fauriei using alkaline buffer on a fetuin-affinity column. Application of a borate-based elution buffer in the present study increased the specific activity of purified lectin from crude protein extract by 2.6-fold, whilst only slightly decreasing the recovery by 1.13%. The biological properties of the lectin eluted with borate buffer were the same as those of the lectin eluted with alkaline buffer such as in terms of the hemagglutination activity, hemagglutination inhibition activity, molecular mass, purity, and cytotoxicity to human breast cancer cells. A prepared biotin-labeled lectin conjugate was used to investigate the binding to various glycoproteins. Our results indicate that eluting with borate buffer is more efficient than using alkaline buffer to isolate the lectin adsorbed in a fetuin-affinity column.
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